Pastiprināšanas jautājumi

1. Kādas problēmas var rasties, PCR pastiprinot?
2. Kāpēc PCR nav pastiprinājuma??
3. Kas izraisa amplifikāciju PCR?
4. Kas izraisa PCR neveiksmi?

Kādas problēmas var rasties, PCR pastiprinot?

Reakcijas produktu agarozes gēla elektroforēzes laikā tiek identificētas daudzas bieži sastopamās PCR un RT-PCR problēmas. Tie ietver paredzamā amplifikācijas produkta neesamību, nespecifisku produktu klātbūtni, pārmērīgu smērēšanos un “primer dimer” joslas klātbūtni.

Kāpēc PCR nav pastiprinājuma??

DNS polimerāzes enzīms nedarbojas

DNS polimerāzes enzīms ir atbildīgs par saistīto praimeru pagarināšanu gar veidnes DNS pavedieniem. Ja šis ferments vairs nav tik efektīvs, iespējams, sasaldēšanas un atkausēšanas dēļ, tad pagarinājuma posms PCR reakcijas laikā būs nepilnīgs, un jums nebūs PCR produkta.

Kas izraisa amplifikāciju PCR?

Pamata PCR. PCR process sākotnēji tika izstrādāts, lai pastiprinātu garākas DNS molekulas īsos segmentus (Saiki et al. 1985). Tipiska amplifikācijas reakcija ietver mērķa DNS, termostabilu DNS polimerāzi, divus oligonukleotīdu praimerus, deoksinukleotīdu trifosfātus (dNTP), reakcijas buferšķīdumu un magniju.

Kas izraisa PCR neveiksmi?

Parasti pirmā lieta, ko pētnieki dara, ir vainot kļūdainu enzīmu vai reaģentu, ja eksperiments neizdodas, bet ar PCR tas faktiski ir mazāk iespējams neveiksmes cēlonis. Biežāk iemesls ir dziļākas iekšējās problēmas, piemēram, gruntējuma dizains, termociklera parametri vai nespecifiska saistīšanās ar citām veidņu sekvencēm.