Pcr pastiprināšanas problēmas

PCR un RT-PCR pastiprināšanas problēmu novēršana

1. Kas izraisa PCR neveiksmi?
2. Kā novērst PCR problēmu?
3. Ko jūs darītu, ja parauga PCR amplifikācija neizdevās?
4. Kas notiek, ja PCR pievienojat pārāk daudz gruntējuma?

Kas izraisa PCR neveiksmi?

Parasti pirmā lieta, ko pētnieki dara, ir vainot kļūdainu enzīmu vai reaģentu, ja eksperiments neizdodas, bet ar PCR tas faktiski ir mazāk iespējams neveiksmes cēlonis. Biežāk iemesls ir dziļākas iekšējās problēmas, piemēram, gruntējuma dizains, termociklera parametri vai nespecifiska saistīšanās ar citām veidņu sekvencēm.

Kā novērst PCR problēmu?

Pārbaudiet atlasīto DNS polimerāžu amplifikācijas garuma iespējas. Izmantojiet DNS polimerāzes, kas īpaši paredzētas ilgstošai PCR. Izvēlieties DNS polimerāzes ar augstu apstrādes spēju, kas var pastiprināt garus mērķus īsākā laikā. Samaziniet atlaidināšanas un pagarināšanas temperatūru, lai veicinātu gruntējuma saistīšanos un fermentu termostabilitāti.

Ko jūs darītu, ja parauga PCR amplifikācija neizdevās?

Ja amplifikācijas reakcija neizdodas un jums ir aizdomas, ka DNS veidne ir piesārņota ar inhibitoru, pievienojiet aizdomīgo DNS preparātu kontroles reakcijai ar DNS veidni un praimeru pāri, kas iepriekš ir labi pastiprinājies .

Kas notiek, ja PCR pievienojat pārāk daudz gruntējuma?

Lietojot augstākas koncentrācijas praimerus, var būt šādas sekas: ja praimeri spēj veidot dimērus, to koncentrācijas paaugstināšana rada tikai primer-dimerus un neuzlabo vēlamā PCR produkta amplifikāciju.