Topmusicanswers
Kopējais DNS daudzums PCR būtiski ietekmē PCR procedūras iznākumu. Izmantojot pārāk daudz kopējās DNS, DNS tvertne tiek iepildīta reakcijas trauka ierobežotā telpā, un tas var izraisīt nepatiesu uzsūkšanos un pat sliktu DNS sintēzi lielo Taq polimerāzes molekulu difūzijas dēļ.
- Cik daudz veidnes man vajadzētu pievienot PCR?
- Vai pārāk daudz primeru var kavēt PCR?
- Kas var izraisīt PCR reakcijas neveiksmi?
- Cik daudz DNS ir pietiekami PCR?
Cik daudz veidnes man vajadzētu pievienot PCR?
Pat ja teorētiski pietiktu ar vienu veidnes molekulu, klasiskajam PCR parasti tiek izmantoti ievērojami lielāki DNS daudzumi, piemēram, līdz 1 µg zīdītāju genoma DNS un tikai 1 pg plazmīdas DNS (1).
Vai pārāk daudz primeru var kavēt PCR?
Piesārņotāji dNTP maisījumā var izraisīt nepilnīgu vai nepareizu amplifikāciju vai PCR inhibīciju. Izmantojiet augstas kvalitātes dNTP. Izmantojot pārmērīgu praimeru koncentrāciju, var palielināties iespēja, ka praimeri nespecifiski saistīsies ar nevēlamām veidnes vietām vai viens otram.
Kas var izraisīt PCR reakcijas neveiksmi?
Aizmirstot tikai vienu PCR reakcijas sastāvdaļu, neatkarīgi no tā, vai tā ir DNS polimerāze, praimeri vai pat veidnes DNS, reakcija būs neveiksmīga. Vienkāršākais risinājums ir atkārtot reakciju. ... Ja pēc tam joprojām nav PCR produkta, iespējams, ka kaut kas cits kavē jūsu reakciju.
Cik daudz DNS ir pietiekami PCR?
Parastā 50 µL reakcijā mērķa DNS amplifikācijai pietiek ar 1–2 vienībām DNS polimerāzes. Tomēr var būt nepieciešams pielāgot fermentu daudzumu ar sarežģītām veidnēm. Piemēram, ja DNS paraugā ir inhibitori, DNS polimerāzes daudzuma palielināšana var uzlabot PCR iznākumu.
